2-9-2-2-1 نشانگرهای DNA مبتنی بر دورگ‌گیری 18

2-9-2-2-2 نشانگرهای مبتنی بر توالی‌یابی 18

2-9-2-2-3 نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 18

2-10 تخمین فاصله ژنتیکی 20

2-11 روش‌های آماری تجزیه تحلیل تنوع ژنتیکی 21

2-12 تجزیه خوشه‌ای 21

2-13 تجزیه به مختصات اصلی 23

2-14 نشانگرهای ISSR 23

2-14-1 نحوه عمل نشانگر ISSR 24

2-14-2 منشا تغییرات چندشکلی در نشانگر ISSR 28

2-14-3 روش تشخیص نشانگر ISSR 30

2-14-4 زمینه کاربرد نشانگر ISSR 30

2-14-4-1 انگشت‌نگاری ژنومی 30

2-14-4-2 نقشه‌یابی ژنوم 31

2-14-4-3 برچسب‌زنی ژن و گزینش به کمک نشانگر 31

2-14-4-4 تعیین تناوب موتیف SSR 32

3-14-4-5 مطالعات در مورد انشعاب جمعیت‌های طبیعی 33

2-15 مروری بر پژوهش‌های انجام شده 34

فصل سوم 47

3-1 مواد گیاهی 47

3-2 مکان و زمان آزمایش 48

3-3 استخراج DNA ژنومی 49

3-3-3 ترکیبات بافر استخراج و ضرورت آنها 49

3-3-2 استخراج DNA 49

3-4 تعیین کیفیت و کمیت DNA 51

3-5 آغازگرهای مورد بررسی 52

3-6 واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) 53

3-6-1 چرخه‌‌ی حرارتی دستگاه ترموسایکر 54

3-6-2 مشاهده محصولات PCR 54

3-7 تجزیه و تحلیل داده‌های مولکولی 55

3-7-1 امتیازبندی باندها 55

3-7-3 شاخص محتوای چند شکلی PIC 56

3-7-4 ضریب کوفنتیک 56

3-7-5 تجزیه به مولفه‌های اصلی 56

فصل چهارم 68

نتایج و بحث 68

4-1 داده‌های مولکولی 68

4-1-1 استخراج DNA 68

4-1-2 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR) 69

4-1-3 تجزیه خوشه‌ای 71

4-1-4 نتایج حاصل از تجزیه به مختصات اصلی 78

4-1-5 محتوای اطلاعات چند شکلی(PIC) 79

فصل پنجم 74

5-1 نتیجه‌گیری 74

5-2 پشنهادات 75

منابع 78

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 2-1 ترکیبات شیمیایی موجود در دانه ذرت 10

جدول 2-2 ده کشور برتر تولیدکننده ذرت در جهان در سال 2012 11

جدول 2-3 مقایسه نشانگرهای مولکولی استفاده شده در اصلاح گیاهان 27

جدول 2-4 اسامی مترادف ISSR و تغییرات آن 28

جدول3-1 مشخصات لاین‌های‌خالص مورد استفاده 48

جدول 3-2 ترکیبات بافر استخراج CTAB 51

جدول3-3 مشخصات نشانگرهای مورد استفاده 52

جدول 3-4 غلظت و ترکیب مواد استفاده شده در واکنش PCR 53

جدول 3-5 چرخه‏های حرارتی واکنش زنجیره‏ای پلیمراز 54

جدول 4-1 شرایط بهینه شده واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای هر نشانگر 70

جدول4-2 میانگین درصد چندشکلی برای هر نشانگر 72

جدول 4-3 ضرایب کوفنتیک دندروگرام‏های مختلف 73

جدول 4-4 ترکیبات امید‌ بخش حاصل از اینبردلاین‌های مورد بررسی 75

جدول4-5 فاصله ژنتیکی جمعیت اینبرد لاین براساس ضریب تشابه تطابق ساده 77

جدول 4-6 میانگین محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) برای هر نشانگر 80

 

 

 

 

 

 

 

شکل2-1 انواع نشانگر 15

شکل 2-2ISSR-PCR ، نمایش اتصال پرایمر(AG)8 به DNA 26

شکل 4-3 چندشکلی حاصل از تکثیر با نشانگرUBC-818 در تعدادی ازلاین‌های‌خالص ذرت، M: نشانگر مولکولی bp1000 70

شکل4-4 دندروگرام حاصل از ماتریس تشابه تطابق ساده و الگوریتم دورترین همسایه با نرم‌افزار NTSYS. لاین شماره یک و دو به ترتیب عبارتند از B73 و Mo17 74

شکل4-5 هیبرید سینگل کراس کارون 701(نگارنده) 75

شکل4-6 هیبرید مبین (نگارنده) 76

شکل 4-7 پلات تجزیه به مولفه‌های اصلی برای 29 اینبردلاین ذرت 79

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

پیوست1- محلول تریس اسید کلریدریک 2 مولار(pH=8،(Tris-HCl 2M 91

پیوست2- محلول اتیلن دی آمین تترااستیک اسید 5/0 مولار(pH=8، EDTA 0/5M) 91

پیوست3- محلول کلرید سدیم 4 مولار(NaCl 4M) 91

پیوست4-بافر Tris-HCl-EDTA 91

پیوست5- بافر TBE 92

 

 

 

 
 
 
فصل اول
مقدمه و اهداف

1-1 مقدمه
ذرت بعلت داشتن هیدرات كربن زیاد و تولید علوفه بالا یكی از بهترین نباتات جهت مصرف در غذای انسان، علوفه جهت دام و مصارف صنعتی می‌باشد. این گیاه در مدت كوتاهی محصول تولید می‌كند. ذرت علوفه‌ای 4-3 ماه بعد از كاشت می‌تواند تا 90 تن در هكتار محصول بدهد. تاریخچه كشت ذرت در ایران زیاد نیست ولی در نتیجه توجه شایانی كه به امر دامپروری و پرورش طیور در كشور به عمل آمده و همچنین نیاز فراوان كارخانجات صنعتی به فرآورده‌های این گیاه و تولید فرآورده‌های فرعی و متعددی كه از ذرت بدست می‌آید باعث گردید كه سطح زیر كشت این گیاه به سرعت افزایش پیدا كند. شرایط آب و هوایی مناسب بالاخص مناطق جنوبی كه به احتمال زیاد مركز اولیه كاشت این گیاه در ایران بود نیز توسعه كشت این محصول را در كشور رونق داد. اهمیت فوق‌العاده ذرت در تامین غذای دام، پرندگان، مصارف دارویی و صنعتی باعث گردید كه در جهت بهبود تكنیك زراعت(به نژادی و به زراعی) آن در كشور اقدامات اساسی بعمل آید و این محصول بتواند پهنه آب و هوایی بیشتری از كشور را به خود اختصاص دهد)لطیفیان و محمدیان، 1389). ذرت از گیاهان زراعی مهم است که سطح وسیعی از اراضی قابل کشت را به خود اختصاص داده است(دهقان نیری و همکاران، 1384، کوتسیکا سوتیریو[1]،1999 و کریمی، 1383). طبق آمار سال 1392 خوزستان بالای 35 درصد از ذرت کشور را تولید می‌کند که 90 درصد این غله در شهرهای شوش، دزفول، اندیمشک، بهبهان، شوشتر و اهواز تولید می‌شود(بی‌نام، 1392). خوزستان دومین استان تولیدکننده ذرت ‌دانه‌ای در کشور محسوب می‌شود(بی‌نام، 1392). انتظار می‌رود به منظور افزایش عملکرد ذرت در آینده نزدیک نیاز به برنامه کارآمدی جهت تثبیت ژرم پلاسم، به منظور بهره‌برداری از هتروزیس بالقوه از این ژرم پلاسم‌ها را داشته باشیم(امیرتیموری و چیذری، 1387). تولید محصول بیشتر این گیاه به علت ذرت هیبریدی است که نسبت به ذرت معمولی قریب 25-20 درصد عملکرد بیشتری دارد(داراح و زبر[2]، 1985،کریمی، 1383 و هالوار[3] و همکاران،2000).

در طی برنامه اصلاحی شناسایی میزان تنوع بین لاین‌های‌خالص بسیار با اهمیت است، چرا که هیبرید‌های خوب از تلاقی لاین‌های‌خالص دورتر از نظر ژنتیکی به دست می‌آیند علاوه بر این بررسی تنوع ژنتیکی در بهبود کیفیت محصولات، مدیریت منابع کشاورزی و ارزیابی بخش امرورزی ذرت اصلاحی بسیار با اهمیت است(سینور[4] و همکاران، 1998و موسی‌آبادی و همکاران، 1389). وسعت و محدوده تنوع ژنتیکی در ژرم‌پلاسم می‌تواند از طریق خصوصیات مورفولوژیکی و نشانگرهای ژنتیکی بررسی گردد. سپس نشانگر مشخص شده به اصلاح‌کنندگان گیاهان کمک خواهد کرد تا رقم مناسبی برای برنامه‌های هیبریداسیون و دورگه‌گیری انتخاب کنند(رضوی‌زاده و احسان‌پور، 1391). همچنین اساس انتخاب در اصلاح نباتات تنوع است. استفاده از صفات مورفولوژیک و گروه‌بند‌ی ژنوتیپ‌های موجودر در ژرم‌پلاسم‌ها بر اساس این صفات و اخیرا نشانگرهای مولکولی DNA به عنوان ابزاری امید بخش در گروه‌بندی لاین‌ها مطرح می‌باشد. تا رقم‌های مناسبی برای برنامه‌های هیبریداسیون و دورگه گیری انتخاب شود. علاوه بر این افزایش تولید با استفاده بهینه از منابع ژنتیکی و تنوع موجود در آن ممکن است. در این راستا به منظور رسیدن به هدف مزبور روش‌های کلاسیک به تنهایی کافی نیست و یا بسیار زمان بر خواهد بود. امروزه با معرفی و کاربرد وسیع نشانگرهای مولکولی آنها را به عنوان مکملی برای مطالعات تنوع از طریق صفات ظاهری موجودات قرار داده است. استفاده از نشانگرهای مولکولی موجب تسریع در پروژ اصلاحی شده و موجب افزایش محصول زراعی و دامی می‌شود(دهقان‌نیری و همکاران، 1384). از طرفی کاهش تنوع ژنتیکی موجب آسیب پذیری شدید محصولات زراعی در برابر تنش‌های محیطی، آفات و بیماری و در نتیجه کاهش عملکرد می‌گردد(عثمانی و سی‌سه مرده، 1388). ویژگی‌های روشن بدست آمده از تنوع ژنتیکی لاین‌های‌خالص با خواستگاه‌های مختلف در ترکیب هیبرید و توسعه اینبردهای جدید موثر می‌باشد(ایکسا[5] و همکاران، 2005).

سه روش عمده در تعیین تنوع ژنتیکی در ژرم‌پلاسم ذرت وجود دارد. که شامل سوابق شجره نامه، صفات مورفولوژیکی و نشانگرهای مولکولی است(کومار و هیروچیکا[6]، 2001). گروه‌بندی بر اساس سوابق شجره‌ای به دلیل نداشتن اطلاعات کافی و یا ناقص بودن آنها امکان پذیر نیست و همچنین گروه‌بندی بر اساس صفات مورفولوژیکی به علت تاثیر محیط بر صفات زراعی کاری مشکل است. امروزه به وفور از نشانگرهای مولکولی به عنوان ابزای ارزشمند در گروه‌بندی لاین‌ها استفاده می‌شود(موسی‌آبادی و همکاران، 1389). نشانگرهای مولکولی خصوصاً در آشکار نمودن تنوع ژنتیکی گیاهان خویشاوند وقتی نشانگرهای فنوتیپی قادر به تشخیص آن نیستند، مفید می‏باشند. نشانگرهای DNA نسبت به نشانگرهای مورفولوژیکی کاراتر و قابل اعتمادتر بوده، از نظر تعداد نامحدود و معمولاً کمتر تحت تأثیر محیط قرار می‏گیرد. اساس این دسته از نشانگرها تجزیه و تحلیل مستقیم DNA می‏باشد. اصول و کاربرد نشانگرهای DNA تقریباً همانند سایر نشانگرهای ژنتیکی مانند نشانگرهای مورفولوژیک و پروتئینی است. در مدت یک دهه نشانگرهای DNA، تکامل قابل توجهی پیدا کردند به‏ طوری که انواع مختلف نشانگرهای DNA با تفاوت‏های زیادی از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه کاربرد، امتیازبندی و تفسیر نتایج ابداع و معرفی گردیدند. بدون تردید، کشف واکنش زنجیره‏ای پلیمراز PCR بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است(نقوی و قره‌ریاضی، 1388).

تکنولوژی نشانگر مولکولی نقش حیاتی در زیست شناسی گیاهی، از جمله انگشت نگاری DNA، نقشه برداری ژنتیکی، روابط فیلوژنتیک و اصلاح مولکولی دارد. تکنولوژی‌های متعدد نشانگری مبتنی بر DNA برای شناسایی چندشکلی‌ها و سنجش زیر مجموعه‌ای از مقدار کل DNA ژنومی توسعه یافته است(کومار و هیروچیکا[7]، 2001). درسال 1994 میلادی نشانگر‏های مولکولی جدید به ‏نام ISSR مطرح شدند(زیتکی‌ویز و رافالسکی[8]، 1994). که این نشانگر‏ها از جمله نشانگر‏های مبتنی ‏بر PCR می‏باشند. نشانگر ISSR یکی از تکنیک‌های ساده و سریع برای تشخیص چندشکلی در نواحی بین دو ریز ماهواره هستند. این نشانگر تکرارپذیر با چندشکلی بالا و قابل اطمینان بوده و روشی بسیار کارآمد برای ارزیابی تنوع ژنتیکی و شباهت درون و بین‌گونه‌ای است(حق‌پناه و همکاران، 1390).

در این پژوهش به منظور بررسی تنوع ژنتیکی 27 اینبردلاین‌های ذرت خوزستان از 15 نشانگر ISSR استفاده گردید.

1-2 فرضیه‌ها
تنوع ژنتیکی در میان لاین‌‌ها‌خالص مورد مطالعه وجود دارد.
نشانگر مولکولی ISSR از دقت مناسبی برای تشخیص این تنوع برخوردار است.
1-3 اهداف اصلی
مطالعه تنوع ژنتیکی لاین‌های‌خاص تولید شده در مرکز تحقیقات صفی آباد خوزستان.
پیش‌بینی بهترین ترکیبات هیبریدی
مدیریت بهتر ژرم‌پلاسم
تعیین گروهای هتروتیک