2-1- بیماری­های گیاهی و مهند سی ژنتیک  5

2-2- توتون “سیستم بیان گیاهی متداول”  6

2-3- معرفی پپتیدهای ضد میکروبی  6

2-3-1- پپتیدهای ضدمیکروبی با منشا حشرات. 7

2-3-2- پپتیدهای ضدمیکروبی شناسایی شده در دیگر حیوانات. 7

2-3-3 – پپتیدهای ضدمیکروبی حاصل از سنتز مصنوعی. 7

2-3-4- پپتیدهای ضدمیکروبی حاصل از میکروارگانیسم­های مهندسی شده. 8

2-3-4-1- باکتری­ها. 8

2-3-4-2- مخمرها. 9

2-3-4-3- گیاهان. 9

2-4- 1- معرفی لاکتوفرین. 11

2-4-2- بررسی ساختار ژنی لاکتوفرین. 11

2-4-3- ویژگی پروتئین لاکتوفرین. 11

2-4-4- نقش پروتئین لاکتوفرین. 12

2-4-5- فعالیت ضد قارچی و ضد باکتریایی پروتئین لاکتوفرین. 12

2-4-6- فعالیت ضد ویروسی پروتئین لاکتوفرین. 13

2-4-7- فعالیت ضد سرطانی پروتئین لاکتوفرین. 13

2-5- ویروس موزاییک خیار(Cucumber mosaic virus)   14

2-6- پژمردگی جنوبی باکتریایی گیاهان تیره سولاناسه  14

3- مواد و روش­ها. 16

3-1- مواد گیاهی  16

3-2- مایع زنی ویروس موزاییک خیار به توتون رقم زانتا  16

3-3- واکنش گیاهان تراریخت و تیپ وحشی به ویروس موزاییک خیار  17

3-4- آزمون الایزا برای ویروس موزاییک خیار  17

3-5- تایید تراریختی  18

3-5-1- استخراج DNA ی ژنومی. 18

3-5-2- انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده ازDNA ژنومی  20

3-6- تهیه ی ژل آگارز و انجام الکتروفورز. 22

3-7- استخراج RNA  23

3-8- تیمار DNase 25

3-9- سنتز رشته اول cDNA  26

3-10- انجام Real-Time PCR جهت مقایسه ی میزان بیان ژن لاکتوفرین در گیاهان تراریخت  27

3-11- انجام Real-Time PCR جهت مقایسه­ی ژن cp ویروس موزاییک خیار در گیاهان تراریخت و تیپ وحشی. 29

3-12- باکتری پژمردگی آوندی R. solonacerum. 30

3-12-1- مواد گیاهی. 30

3-12-2-کشت باکتری R. solanacearum و مایه زنی آن به گیاهان تراریخته. 31

4- نتیجه گیری. 33

4-1- مشاهده­ی علایم. 33

4-1-1- توتون­های تیپ وحشی. 33

4-1-2- ظهور علایم درتوتون­های تراریخت. 34

4-2- آزمون الایزا. 36

4-2-1- آزمون الایزا زمان صفر(زمان ظهور علایم در تیپ وحشی)  37

4-2-2- آزمون الایزا زمان20روز بعد از مایه زنی ویروس موزاییک خیار. 37

4-3- استخراج DNAگیاهان تراریخت  39

4-3-1- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای تایید وجود ژن لاکتوفرین در گیاهان تراریخت. 39

4-4- استخراج RNAو ساخت cDNA  40

4-5- انجام Real Time PCR. 42

4-5-1- انجام Real Time PCR برای ژن لاکتوفرین. 42

4-5-2- انجام Real Time PCR برای ژن cp ویروس موزاییک خیار  43

 

4-6- مایه زنی باکتری R. solonaserum به توتون. 46

6- بحث. 47

7- منابع. 49

 

 
 

 

 

 

فهرست جدول‌ها

عنوان…………………………………… …………. صفحه

جدول 3-1- محول ضدعفونی کننده بذر توتون.. 16

جدول 3-2- تهیه ی بافر استخراج DNA.. 19

جدول 3-3- پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر و تایید ژن لاکتوفرین   20

جدول 3-4- سیکل گرمایی استفاده شده در هر واکنشPCR 21

جدول 3-5- مواد استفاده شده در هر واکنش PCR.. 22

جدول 3-6- نوع و میزان مواد به کار رفته برای تیمار DNase. 25

جدول 3-7- مواد مورد استفاده در مرحله اول سنتز cDNA.. 26

جدول 3-8- مواد مورد استفاده در مرحله دوم سنتز cDNA.. 27

جدول 3-9- آغازگرهای به کار رفته ژن لاکتوفرین برای Real-Time PCR و ژن کنترل داخلی.. 27

جدول 3-10- میزان مواد به کار رفته در Real –Time PCR ژن لاکتوفرین و ژن Ef به عنوان کنترل داخلی…….. 28

جدول 3-11- سیکل گرمایی استفاده شده در Real-Time PCR ژن لاکتوفرین و ژن کنترل داخلی.. 29

جدول 3-12- میزان مواد به کار رفته در Real –Time PCR ژنcp ویروس موزاییک خیار و ژن Ef به عنوان کنترل داخلی.. 30

جدول 3-13- سیکل گرمایی استفاده شده در Real-Time PCR ژن cp ویروس موزاییک خیار و ژن کنترل داخلی.. 30

جدول 4-1- تاخیر ظهور علایم پس از 15 روز از مایه زنی ویروس موزاییک خیار در گیاهان تراریخت.. 36

 

 
 

فهرست شکل ها

عنوان……………………………………………………………………………………………………………………………… صفحه

 

شکل 4-1- ظهور علایم در توتون های تیپ وحشی.. 33

شکل 4-2- گیاهان تراریخت هنگام ظهور علایم در تیپ وحشی‌ها.. 34

شکل 4-3- گیاهان تیپ وحشی بعد از 30 روز مایه زنی ویروس موزاییک خیار.. 34

شکل 4-4- گیاهان تراریخت پس از 15 روز از ظهور علایم در تیپ وحشی­ها   35

شکل 4-5- آزمون الایزا در زمان صفر.. 37

شکل 4-6- رشد ویروس در تراریخت ها و تیپ وحشی در 20 روز بعد ازمایه زنی ویروس موزاییک خیار.. 38

شکل 4-7- آزمون الایزا در زمان 30 روز بعد مایه زنی ویروس موزاییک خیار.. 39

شکل 4-8- نقوش الکتوفروزی محصول PCR با پرایمرهای partial ژن لاکتوفرین.. 40

شکل 4-9- استخراج RNA از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی.. 40

شکل 4-10- نقوش الکتروفورز PCR آغازگرهای Real-Time با آغازگرهای ژن لاکتوفرین:.. 41

شکل 4-11- تیمار DNase توتون تیپ وحشی پس از 22 روز از مایه زنی باکتری.. 41

شکل 4-12- نتایج حاصل از Real-Time PCR ژن لاکتوفرین در لاین­های تراریخت.. 42

شکل 4-13- نتایج حاصل از Real-Time PCR ژن cp ویروس موزاییک خیار   43

شکل 4-14- کشت عصاره ی حاصل از گیاهان تراریخت و تیپ وحشی.. 44

شکل 4-15- پژمرده گی گوجه پس از 26 روز از مایه زنی باکتری   45

شکل 4-16- توتون تراریخت 22 روز بعد از مایه زنی باکتری R. solonaserum.. 45

شکل 4-17- توتون تیپ وحشی 22 روز بعد از مایه زنی باکتری R. solonaserum.. 45

 

 

 

 

فصل اول

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1-­ مقدمه
 

براساس یک تخمین محافظه کارانه، بیماری­ها، حشرات و علف های هرز در سطح جهانی سالانه بین 31 تا 42% محصولات کشاورزی را نابود کرده و یا از تولید آن­ها جلوگیری می­کنند. میزان خسارت به طور معمول در کشورهای پیشرفته و در کشورهای در حال پیشرفت که نیاز غذایی بیشتری دارند، بالاتر است (Tisdell and Xiang, 1998). اگر متوسط میزان خسارت را 5/36% بگیریم، سهم بیماری ها، حشرات و علف های هرز دراین خسارت به ترتیب 1/14%، 2/10% و 2/12% شده است. با توجه به اینکه بیماری ها به تنهایی موجب نابودی 1/14% محصولات می شوند، مقدار خسارت سالانه آن­ها در سطح جهانی بالغ بر220 میلیارد دلار می شود (Wood and Derek, 2001).

طی یک صد سال گذشته، کنترل بیماری­ها و سایر آفات گیاهی به طور فزاینده­ای به استعمال مواد شیمیایی سمی وابسته است. کنترل بیماری­های گیاهی اغلب کاربرد این مواد سمی را نه تنها بر روی گیاه و محصولات گیاهی مورد استفاده­ی ما، بلکه درون خاک جایی که بسیاری از میکروارگانیزم­های بیماری­زا زندگی کرده و به ریشه­ی گیاه حمله می­کنند، ضروری ساخته است. بسیاری از این مواد شیمیایی برای میکروارگانیزم­های غیر هدف، حیوانات و حتی برای انسان نیز ممکن است سمی باشند. دشوار است که بتوان هزینه­های بلند مدت و کوتاه مدت آلودگی محیط زیست بر سلامتی و به­زیستی انسان را که براثر تلاش ما برای کنترل بیماری های گیاهی و سایر آفات به وجود می آید، تخمین زد. شمار زیادی از بیمارگرهای گیاهی از ویروئیدهای دارای چند صد نوکلئوتیدی تا گیاهان عالی در محصولات کشاورزی ایجاد بیماری می­کنند. دامنه­ی اثرات این بیماری زا از اثرات خفیف تا نابودی کامل محصول است. گروه­های عمده بیمارگرها شامل ویروس­ها، باکتری­ها، قارچ­ها، اوومیست­ها، ویروس­ها و نماتدها می­باشند. کنترل عوامل بیماری­زای گیاهی مشکل است زیرا جمعیت آنها بسته به زمان، مکان و نوع ژنوتیپ متغیر است. بنابراین برای مبارزه با تلفاتی که آن­ها به وجود می ­آورند، لازم است به تعریف مشکل پرداخت و به دنبال راه­حل­هایی بود. در سطح زیستی نیاز به روش­هایی برای تشخیص دقیق و سریع اورگانیزم ایجاد کننده­ی، بیماری تخمین دقیق شدت بیماری، اثر بیماری روی محصول و تشخیص مکانیسم ­های بیماری­زایی می­باشد. در مرحله­ی بعد خسارت بیماری باید به وسیله­ی کاهش مایه تلقیح بیمارگر، کاهش مکانیسم های بیماری­زایی آن و افزایش گوناگونی ژنتیکی در محصول به حداقل برسد (Reed et al., 2003). هدف بیشتر پژوهش­های جدید در بیماری­شناسی گیاهی یافتن شیوه­های دیگر برای کنترل بیماری­های گیاهی است که به محیط زیست آسیب کمتری برسانند. روش­های انتقال در سال­های اخیر به عنوان یک موضوع مهم برای ایجاد مقاومت مورد بررسی قرار گرفته است. امید ­بخش­ترین این روش­ها عبارتند از:

تولید گیاهان مقاوم به بیماری از طریق مهندسی ژنتیک
تولید گیاهان مقاوم به بیماری از طریق به­نژادی گیاهی سنتی
کاربرد فنون زراعی برای سرکوب بیماری
کاربرد فنون خاموشی ژن
استفاده از مواد غیر سمی افزایش دهنده­ی مقاومت
بهره­وری از عوامل زیستی ناهمساز به میکرواورگانیزم­های مولد بیماری (ایزدپناه و همکاران، 1389 و Strange et al., 2005)
با توجه به ضرورت ارقام گیاهی مقاوم به تنش­های زیستی و غیر زیستی و نارسایی روش­های سنتی به­نژادی گیاهی، به کارگیری روش­های موثر تنها راه برون رفت از این مشکل می­باشد. در سال­های اخیر، با پیشرفت بدست آمده از در زیست شناسی مولکولی و روش­های کشت بافتی گیاهی روش­های جدیدتر و کارآمدتری را در مهندسی ژنتیک، برای چیره­گی بر محدودیت­های به­نژادی گیاهی سنتی فراهم کرده است. بنابراین استفاده از مهندسی ژنتیک برای دستیابی به ارقام مفید می باشد. با استفاده از فنون انتقال ژن، گیاهان تراریخت با یک ویژگی مشخص می توانند یک ژن از منبع ژنی متفاوت دریافت نمایند به نحوی که سایر ویژگی­های مطلوب گیاه تحت تاثیر قرار نگیرد. بنابراین ­کاربرد سموم شیمیایی هنوز موثرترین روش برای کنترل بیماری­های گیاهی هستند، اما کاربرد بیش از اندازه­ی باکتری­کش‌ها و قارچ­کش­ها­ی شیمیایی منجر به شدید شدن و طولانی شدن دوره­های آلودگی محیط زیست و مقاوم شدن بیمارگرها نسبت به این سموم شده است (Daoubi et al., 2005). اگرچه روش­های اصلاحی یکی از موثرترین راهکارها در تولید گیاهان مقاوم به بیماری­ها بوده اما این روش دارای محدودیت­هایی مانند فقدان پل ژنی دهنده­ی مناسب و شکستن مقاومت می­باشد. از سوی دیگر روش­های بیوتکنولوژی به طور موفقیت­آمیزی در تولید محصولات گیاهی مقاوم علیه بیمارگرها و آفات موثر بوده است، در این روش­ها ژن بیان کننده­ی پپتید­های ضدمیکروبی را در گیاهان بیان کرده و باعث مقاومت گیاه به بیماری مورد نظر شده است (Tingquan et al., 2013).

1-1- ­ پپتیدهای ضد میکروبی
پپتیدهای ضد میکروبی یکی از اجزای سیستم ذاتی ایمنی محسوب می­شود که معمولا به عنوان اولین خط دفاعی علیه پاتوژن­ها عمل می­کنند. چند ویژگی که معمولا در همه­ی پپتید­های ضد عمومیت دارد شامل: توالی کوتاه بین 30 تا60 اسید آمینه آمینه، خاصیت کاتیونی قوی، قابلیت تحمل دما تا 100 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه می­باشد. پپتیدهای ضد میکروبی بوسیله­ی موجودات مختلف تولید می­شوند که شامل باکتری­ها حشرات، گیاهان و مهره داران می باشد (Boulanger et al., 2006). پپتید­های ضد میکروبی طیف وسیعی از میکروارگانیسم­ها شامل باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی، قارچ­ها، میکروپلاسماها و ویروس­ها را کنترل می­کنند. بیش از 1500 پپتید ضد میکروبی در جانوران، گیاهان و میکروارگانیسم­ها شناسایی شده است (Parachin et al., 2012 ; Li et al., 2012).

بیان ژن­های کد کننده­ی پپتیدهای ضدمیکروبی با منشا گیاهی در گیاهان تراریخته باعث تغییر کمی در مقاومت گیاه علیه بیمارگرهای گیاهی می شود، زیرا بیمارگر با گیاه در یک مدت طولانی با هم تکامل یافته­اند اما بیان ژن های کد کننده­ یپپتیدهای ضدمیکروبی از منابع دیگر در گیاهان منجر به سطح بالایی از مقاومت در برابر طیف وسیعی از بیماری­ها شده است (Burrowes et al., 2005).

 

1-2- پروتئین لاکتوفرین
پروتئین لاکتوفرین یکی از اعضای خانواده­ی ترانسفرین ها می باشد که دارای خاصیت اتصال شونده­گی به آهن است. لاکتوفرین­ها اغلب آمفی­پاتیک حاوی بار مثبت و مناطق هیدروفیل هستند که به دومین مولکول­های حاوی بار منفی در سطح میکرواورگانیسم متصل می­شوند که این مکانیسم به لاکتوفرین اجازه می­دهد به راحتی با غشا باکتری که شامل مجموعه­ای از مولکول­های آمفی­پاتیک می­باشد، واکنش دهد، مخصوصا با باکتری­هایی که سطح غشا آن­ها دارای بار منفی می­باشند (Legrand and Mazurier, 2010 ).

 

1-3- هدف
در این پروژه بیمارگرهای باکتریایی و ویروسی به گیاهان ترایخت نسل دوم توتون حاوی ژن لاکتوفرین شتر عربی با هدف ایجاد مقاومت توتون­های تراریخت نسبت به این بیمارگرها مایه­زنی گردید.

 

 

 

 

 

 

فصل دوم

 

 

 

 

 

 

2- مروری بر پژوهش­های پیشین
2-1- بیماری­های گیاهی و مهند سی ژنتیک
با تشخیص القای تومور درگیاهان توسط Agrobacterium tumefaciens به­واسطه­ی انتقال T-DNA موجود روی پلاسمید باکتری ایجاد می­شود، کاربرد از آن برای ایجاد گیاهان تراریخت معمول شده است. اگر چه از تکنیک­های دیگری مانند الکتروپوراسیون[1] و بیولیستیک[2] نیز استفاده می­شود. روش های سنتی به­نژادی گیاهان شامل تلاقی­های مختلف و روش­های درون شیشه­ای مکمل این روش­ها در ایجاد گیاهان با صفات مطلوب می­باشند. در سال­های اخیر ظهور روش­های مهندسی ژنتیک به عنوان ابزاری جدید در تحقیقات کشاورزی همسو با به­نژادی سنتی در گسترش روش­های جدید برای دستورزی ژنتیکی گیاهان نقش بسیار مهمی ایفا کرده است. یکی از شاخه­های زیست فناوری گیاهی انتقال ژن­های خاص به سلول­های گیاهی و یا بازایی گیاه از این سلول‌ها با استفاده از روش­های کشت بافت گیاه می­باشد. بنابراین زیست فناوری این پتانسیل را دارد که با تولید گیاهان با خصوصیات بهبود یافته مکمل روش­ها­ی سنتی به نژادی گیاهان شود. بر خلاف روش­های به نژادی سنتی که در آّن دسته­ای از ژن­ها منتقل می­شود (Wood and Derek, 2001). در روش­های مبتنی بر زیست فناوری می­توان یک ژن مشخص را از هر موجودی انتخاب و به جاندار دیگر انتقال داد. سوالی که در روش­ها­ی مهندسی ژنتیک مطرح می­شود این است که چه ژن­های باید منتقل شوند که پاسخ به این سوال بستگی به نوع هدفی که در انتقال ژن دنبال می شود، دارد. در مبارزه با بیماری­ها با استفاده از مهندسی ژنتیک دسته اول ژن­های کاندیدا برای انتقال ژن­های هستند که ویژگی­های بیماری­زای بیمارگر به عنوان مثال آنزیم­های تجزیه کننده توکسین­ها را باز داشته یا آن را از بین می­برند یا ژن­هایی که مقاومت گیاه را افزایش می­­دهند. دسته بعدی ژن­هایی هستند که غلظت پپتید­های ضد­میکروبی را افزایش می­دهند (Strange et al., 2005).

ژن­های جانوری که از آنها می توان برای ایجاد مقاومت در گیاهان استفاده کرد بسیار متنوع هستند که از حشرات، پستانداران و خزندگان قابل جداسازی هستند به عنوان نمونه سکروپین[3] و دفنسین[4] حشرات، برنینز[5] قورباغه، ایندولوسیدین[6] گاو نمونه­هایی از پروتئین­های ضد میکروبی هستند که ژن آنها قابل انتقال به گیاهان است (Li et al., 2012). از دیگر ژن­های با خواص ضدمیکروبی می توان به لاکتوفرین و لیزوزیم پستانداران اشاره کرد.

 

2-2- توتون “سیستم بیان گیاهی متداول”
توتون با نام علمی Nicotiana tabacum به عنوان یک سیستم بیان گیاهی مدل است که در سطح گسترده، جهت انتقال ژن­های مختلف بکار رفته است و بیشترین استفاده را در بین گونه­های گیاهی به خود اختصاص داده است. از بهترین دلایل انتخاب آن، می توان به انعطاف­پذیری و آسانی نسبی دستورزی ژنتیکی، ایجاد عملکرد سالانه بیش از 100 تن در هکتار و تولید بذر فراوان در گیاه اشاره کرد (Strange et al., 2005).

توتون یک محصول خودگرده افشان است و خویشاوندان زراعی یا وحشی کمی دارد. بنابراین امکان فرار ژن در این حالت بسیار کم است و بنابراین بر خلاف بسیاری از سیستم­های گیاهی، توتون مناسب­ترین شرایط را از نظر مسایل ایمنی زیستی و اخلاق زیستی دار است و کمترین احتمال آلودگی زنجیره­های گیاهی و جانوری را داراست )قاسم پور و همکاران، 1386).

 

2-3- معرفی پپتید های ضد میکروبی
پپتیدهای ضد میکروبی بوسیله­ی موجودات مختلف تولید می­شوند که شامل باکتری­ها حشرات، گیاهان و مهره داران می­باشند (Boulanger et al., 2006). همانطور که قبلا بحث شد چند روش برای گسترش تولید [7]AMPدر سیستم­های میکروبی وجود دارد که از جمله­ی آن به کنترل رونویسی و تولید پروتئین نوترکیب می­باشد، اما سیستم بیانی گیاهان به عنوان یک جایگزین مناسب برای تولید پپتیدها بدون نیاز به کنترل رونویسی، توانایی بیان در سطح بالا و فرایندهای پس از ترجمه گیاه می باشد مورد توجه قرار گرفته­اند (Haung et al., 2009). این پپتیدهای دارای شش سیستئن در توالی خود می­باشند که تشکیل سه باند دی­سولفیدی می­دهند (Craik, 2011). این کمپلکس ساختار سه تایی از طریق پیش­سازش جداشده، خارج می­شود و تا می­خورد که نتیجه­ی آن تولید پپتید بالغ می­باشد. و پیشنهاد شده که پپتید اولیه به همراه یک آنزیم واکوئلی به نام آسپارزینیل اندوپپتیداز[8] با دو فعالیت اندوپپتیدازی و تشکیل ساختار صحیح پروتئین این فرایند را انجام می­دهد (Craik et al., 1999).

پپتیدهای ضدمیکروبی با توجه به منشاشان به چهار گروه تقسیم بندی می­شوند:1- حشرات 2- دیگر حیوانات 3- شیمیایی 4- از طریق میکروارگانیسم­های مهندسی شده تولید می­شوند. امروزه بیش از 1500 پپتید ضدمیکروبی از منشاهای متفاوت گزارش شده است (Varadhachary and Gauri, 2010).

 

2-3-1- پپتید های ضد میکروبی با منشا حشرات
این نوع پپتیدها هم القایی هستند و هم به صورت همیشه بیان می­باشند. امروزه بیش از 200 پپتید در حشرات شناسایی شده این پپتید­ها به پنج گروه بر اساس توالی اسید آمینه و فعالیت آنتی باکتریایی تقسیم بندی می شوند. که عبارتند از سکروپین­ها، دفنسین حشرات، پپتید غنی از پرولین، پپتیدهای غنی از گلیسین و لیزوزیم­ها(Li et al., 2012) .

 

2-3-2- پپتیدهای ضد میکروبی شناسایی شده در دیگر حیوانات
این پپتیدها توالی متنوع، ساختار و بافت هدف خاصی را نشان می­دهند. بیان این پپتیدها در اکثر بافت­ها و انواع مختلفی از سلول­ها و سطح گسترده­ای از انواع گونه­های مختلف شامل پستانداران، دوزیستان و ماهی­ها بیان می شوند. در بیشتر مهره­داران با یک لایه­ی دایره­ای خنثی حفظ می­شود (Li et al., 2012).

 

2-3-3 – پپتید های ضد میکروبی حاصل از سنتز مصنوعی
سنتز مصنوعی با استفاده از روش فاز جامد انجام می­گیرد که در این روش ابتدا اسید آمینه­ای که انتهای آن دارای انتهای آمینی می­باشد، محافظت شده به فاز جامد متصل می­شود سپس مولکولی که به قسمت انتهای آمینی چسبیده برداشته شده و اسید آمینه­ی دیگر اضافه شده و به همین ترتیب ادامه داده تا پپتید مورد نظر ساخته شود. ازجمله مشکلات سر راه در سنتز پپتید هزینه­ی زیاد، وجود باندهای دی­سولفیدی و تغییرات پس از ترجمه می باشد (Wang et al., 2012).

 

2-3-4- پپتیدهای ضد میکروبی حاصل از میکروارگانیسم­های مهندسی شده
پیشرفت در تکنولوژی DNAی نوترکیب فرصتی را برای تولید AMPها در مقیاس وسیع فراهم کرده است. این تکنولوژی قادر است ژن بیگانه را در ناقل های مخصوص جاسازی و در پروکاریوت­ها و سلول­های یوکاریوت میزبان بیان کند. با توجه به اینکه موثرترین روش برای صرفه­جویی در زمان و کاهش هزینه می­باشد و علاوه بر این تولید پپتید با استفاده از تکنیک زیست مولکولی می­تواند در بخش­های مختلف صنعتی به کاررود (Rao et al., 2005). با توجه به اندازه­ی پپتید، جایگاه و ترشح داخل سلولی پپتید، نحوه­ی تاخورده­گی و الگوهای قنددار شدن پپتیدها، میزبان‌های متفاوتی وجود دارد. باکتری­ها و مخمرها 96 درصد میزبان­ها را در تولید AMPها به خود اختصاص دادند و درحالی که گیاهان نقش کمرنگ تری در تولید AMP ها دارند (Parachin et al., 2012).

 

2-3-4-1- باکتری ها

موتورهای القایی به دلیل سادگی و استحکام ساختمان، ارزانی، محدوده وسیع سرعت و پاره‌ای مزایای دیگر کاربرد گسترده‌ای پیدا کرده‌اند. به همین دلیل پایش وضعیت این نوع موتورها جهت شناسایی خطاها در مراحل اولیه پیدایش آن‌ها، به ویژه در توان‌های زیاد، اهمیت زیادی دارد. بنابراین تشخیص خطای اتصال حلقه در زمان‌های اولیه وقوع آن می‌تواند مزیت‌های زیر را در بر داشته باشد‌:
– جلوگیری از آسیب عمده به موتور و تعمیرات زمان‌بر و پر هزینه آن.
– جلوگیری از توقف غیر منتظره خط تولید.
– کاهش تلفات.
حصول مزیت‌های فوق مستلزم اطلاع به هنگام از شدت و موقعیت (فاز) خطای اتصال حلقه موتور است. این امر معمولا از طریق آشکارسازی بعضی آثار مترتب بر رفتار موتور در اثر بروز خطا میسر است. معایب موتورهای القایی را می‌توان به سه گروه اصلی‌: مکانیکی، روتور و استاتور تقسیم کرد. هر کدام از این خطاها ریشه در عوامل متفاوتی دارند و آثار مختلفی بر عملکرد موتور می‌گذارند. حتی بعضی از خطاها ممکن است خود منشا بروز خطاهای دیگر شوند.
خطاهای مکانیکی عمدتاٌ از خطای یاتاقان‌ها (بلبرینگ‌ها) ناشی می‌شوند ]1و2 [. بعضی عوامل ایجاد خطای یاتاقان عبارتند از : روغن کاری نامناسب یا ناکافی، تنش‌های شعاعی و محوری سنگین بدلیل انحراف محور ومونتاژ، تنظیم یا فونداسیون ضعیف. این عوامل سبب تسریع در سایش و فرسایش یاتاقان ها می‌شوند. معمولا خطای یاتاقان‌ها بروز خطای نا هم‌محوری روتور و استاتور را نیز در پی دارند. تشدید خطای اخیر می‌تواند منجر به تماس سطوح روتور و استاتور شده و معایب روتور و استاتور را پدید آورد.
شکستن میله‌های روتور، شکستن حلقه انتهایی روتور و انواع نا هم‌محوری (استاتیکی، دینامیکی و مرکب) از جمله خطاهای روتور هستند ]3[. دلایل اصلی بروز این خطاها به شرح زیرند :
1. اضافه بار حرارتی که می‌تواند حین شتابگیری، کارکرد دایم و یا توقف روتور حاصل شود.
2. عدم تعادل حرارتی یا اختلاف دما در میله‌های روتور که از راه اندازی‌های مکرر، پدیده پوستی، انتقال حرارت غیر یکنواخت هسته و میله‌های روتور و بعضی عوامل دیگر ناشی می‌شود.
3. اثرات مغناطیسی که منجر به وارد شدن نیروهای الکترودینامیکی شعاعی بر میله‌ها می‌شوند. این نیروها که از تاثیر متقابل شار مغناطیسی و جریان میله‌ها حاصل می‌شوند، با مربع جریان میله‌ها متناسب بوده و سبب لرزش و خمش میله‌ها در امتداد شعاعی شده و سرانجام ممکن است منجر به شکستن میله‌های روتور شوند.
4. غیر یکنواختی ذاتی در امتداد طولی فاصله هوایی (نا هم‌محوری ذاتی) که از ایده‌آل نبودن فناوری ساخت و مونتاژ موتور ناشی می‌شود، باعث کشش مغناطیسی نامتقارن در سطوح مجاور روتور و استاتور می‌شود. زیرا روتور در سمتی که فاصله هوایی کوچکتر است تحت نیروهای کششی بزرگتری قرار می‌گیرد. این امر سبب خم شدن روتور، تشدید خطای نا هم‌محوری و در نهایت منجر به برخورد روتور با استاتور می‌شود. در نتیجه ممکن است به ساختار روتور و استاتور آسیب جدی وارد شود.
5. افزایش تنش‌های وارد بر میله‌های روتور در اثر اضافه بار دایم یا نوسانی در طول زمان می‌تواند منجر به شکستن میله‌های   روتور شود.
6. افزایش نیروهای گریز از مرکز در اثر افزایش سرعت موتور به بیش از سرعت اسمی می‌تواند منجر به بروز تنش‌هایی در حلقه‌های انتهایی و شکستن اتصال بین میله‌های روتور و حلقه‌های انتهایی گردد.
استاتور موتورهای القایی نیز همانند بلبرینگ‌ها و روتور می‌تواند تحت تاثیر عوامل مختلفی دچار خطا شود]3[ . پنج نوع خطا برای سیم پیچ‌های استاتور گزارش شده‌اند که همه آنها ریشه در خرابی عایق سیم‌پیچ‌ها دارند ]4[ این خطاها عبارتند از:
1- خطای حلقه به حلقه در یک کلاف که در آن دو نقطه از یک یا چند حلقه از یک کلاف به همدیگر اتصال پیدا می‌کنند (خطای اتصال حلقه).
2- خطای کلاف به کلاف در یک فاز که در آن یک نقطه از یک کلاف به یک نقطه از کلاف دیگر سیم‌پیچی همان فاز اتصال پیدا می‌کند.
3- خطای فاز به فاز که در آن نقطه‌ای از سیم‌پیچ یک فاز به نقطه‌ای از سیم‌پیچ یک فاز دیگر اتصال پیدا می‌کند.

بیان مسأله                                                                 2

پرسش پژوهش                                                           3

ضرورت پژوهش                                                           3                                                                                                  

هدف پژوهش                                                             4                                                                                                     

سابقه پژوهش                                                             5

روش تحقیق                                                              8

سامان دهی تحقیق                                                       8                                                                                               

فصل دوم: تبیین مفاهیم و سابقه ی تقنینی مجازات های تکمیلی       10                                                         

مبحث اول: مفهوم مجازات های تکمیلی و ماهیت آنها                11                                               

گفتاراول: تعریف مجازات تکمیلی                                       11                                                                   

گفتاردوم: تبیین ماهیت مجازات های تکمیلی                         24                                          

مبحث دوم: سابقه ی تقنینی مجازات هاى تکمیلى                             25                                                      

          گفتاراول: سابقه تقنینی مجازات های تکمیلی پیش از انقلاب                 25                        

          گفتاردوم: سابقه تقنینی مجازات های تکمیلی پس از انقلاب                  28                          

فصل سوم: موقعیت مجازات های تکمیلی در واکنش های جزایی        33                                   

مبحث اول: واکنش های کیفری                                         34

           گفتاراول: تعریف و انواع واکنش های کیفری                         34                                                 

بنداول: تعریف واکنش های کیفری                                     35                                                   

بند دوم: انواع واکنش های کیفری                                                37                                                    

گفتاردوم: رابطه ی مجازات های تکمیلی با واکنش های کیفری     43                    

بنداول: ماهیت تعزیری مجازات های تکمیلی                          44                                  

بنددوم: مجازات های مکمل حدود و قصاص                           45                                     

بندسوم: تمایز در اهداف و ویژگی ها با سایر واکنش های کیفری      46

مبحث دوم: واکنش های غیرکیفری                                    50

گفتاراول: تعریف و انواع واکنش های غیرکیفری                       50                                         

بنداول: مفهوم واکنش های غیرکیفری                                  50                                       

بنددوم: انواع واکنش های غیرکیفری                                   51                                         

گفتاردوم: رابطه ی مجازات های تکمیلی با واکنش های غیر کیفری          55       

فصل چهارم: نسبت مجازات های تکمیلی با انواع تعزیرات                  59                                     

مبحث اول: انواع واکنش های تعزیری غیرکیفری                      60                                              

 

گفتاراول: رابطه ی مجازات های تکمیلی با اقدامات تأمینی و تربیتی         60     

بنداول: مفهوم اقدامات تأمینی و تربیتی                                    61

بنددوم: وجوه افتراق مجازات های تکمیلی ازاقدامات تأمینی وتربیتی        63              

گفتار دوم:  رابطه ی مجازات های تکمیلی با تأدیب                            68                              

بنداول: مفهوم تأدیب                                                     69

بنددوم: ماهیت تأدیبی برخی از مجازات های تکمیلی                73                   

مبحث دوم: انواع واکنش های تعزیری به اعتبار موجبات آنها                  75                          

گفتاراول: تعزیرات شرعی                                                75

بنداول: مفهوم تعزیرات شرعی                                           75                                                

بنددوم: نسبت مجازات های تکمیلی با تعزیرات شرعی               80          

گفتاردوم: تعزیرات حکومتی                                             82

بنداول: مفهوم تعزیرات حکومتی                                        82                                           

          بنددوم: نسبت مجازات های تکمیلی با تعزیرات حکومتی                86                  

نتیجه گیری                                                                                         88  

منابع                                                                                                    95                                                                     

1.بیان مسأله

مجازات هاى تکمیلى نخستین بار با عنوان «کیفرهاى تکمیلى» در ماده ى 19 اصلاحى قانون مجازات عمومى، مصوب 7/4/1328، بند الف در فصل سوم تحت عنوان «در جزاهاى تبعى»، به صورت مصادیق کیفرهاى تبعى و تکمیلى بیان شده بود.

در ماده 23 قانون مجازات مصوب 1392، نیز اقداماتی تحت عنوان مجازات های تکمیلی پیش بینی شده است.

نکته ی قابل تأمل در خصوص اقدامات مذکور در ماده ی 23 قانون مجازات مصوب 1392، قرار دادن عنوان مجازات بر اینگونه اقدامات از سوی قانونگذار می باشد؛ به گونه ای که برخی حقوقدانان با توجه به این عملکرد، آنها را در ردیف مجازات ها قرار داده و قائل به ماهیت کیفری این دسته از اقدامات می باشند.

قرار دادن اقدامات مذکور در ماده 23 قانون مجازات مصوب1392 در زمره ی واکنش های کیفری مشکلاتی ایجاد خواهد کرد من جمله اینکه، با توجه به ثابت و مشخص بودن مجازات در مقابل ارتکاب جرایم حدی و جنایات، امکان اعمال واکنش کیفری مضاعف در کنار حدود و قصاص، چندان قابل توجیه به نظر نمی رسد.

هم چنین با توجه به ماهیت تعزیری اقدامات مذکور در ماده ی 23 قانون مجازات مصوب 1392، با قرار دادن اینگونه اقدامات درکنار مجازات اصلی تعزیری، مجموع مجازات تعزیری اعمال شده بر مرتکب، عمدتاً بیش از مجازات های حدی می گردد، فلذا این اقدام خلاف قاعده ی دون الحد در تعزیرات می باشد.

بنابراین به نظر می رسد می بایست اقدامات مذکور در ماده ی 23 قانون مجازات مصوب 1392 را که با عنوان «مجازات های تکمیلی» مشخص شده اند، به عنوان اقداماتی غیرکیفری در مقابل ارتکاب جرم محسوب کرد. 

لذا باید گفت مقصود قانونگذار از مجازات های تکمیلی، لزوماً نوعی واکنش کیفری علیه جرم نمی باشد، بلکه مراد از آن واکنشی مستقل، در مقابل ارتکاب عمل مجرمانه، صرفنظر از ماهیت کیفری یا غیرکیفری این اقدامات است.

2.پرسش پژوهش

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                          صفحه

فصل اول: مقدمه و کلیات

1-1- کلیات…………………………………………………………………………………………………………………….. 3

1-2- ضرورت تحقیق……………………………………………………………………………………………………….. 5

1-3- اهداف مورد مطالعه در این تحقیق…………………………………………………………………………….. 7

1-4- معرفی ماهی کلمه……………………………………………………………………………………………………. 7

1-5- رده بندی ماهی کلمه……………………………………………………………………………………………….. 7

1-6- مشخصات ظاهری ماهی کلمه……………………………………………………………………………………. 8

1-7- صید ماهی کلمه………………………………………………………………………………………………………. 9

1-8- تغذیه ماهی کلمه……………………………………………………………………………………………………… 9

1-9- تولیدمثل ماهی کلمه………………………………………………………………………………………………… 10

1-10- ریخت‌سنجی……………………………………………………………………………………………………….. 10

1-11- شکل و اندازه……………………………………………………………………………………………………… 13

1-12- شکل………………………………………………………………………………………………………………….. 13

1-13- نقطه‌گذاری یا لندمارک گذاری………………………………………………………………………………. 14

1-14- ریخت‌سنجی هندسی……………………………………………………………………………………………. 16

1-15- روی‌هم‌گذاری……………………………………………………………………………………………………… 19

1-16- آنالیز پروکراستی تعمیم یافته…………………………………………………………………………………. 19

1-17- آلومتری………………………………………………………………………………………………………………. 20

1-18- کاربرد آنالیزهای آلومتری شکل و ریخت‌سنجی هندسی…………………………………………… 23

1-19- شبکه تغییرات شکلی…………………………………………………………………………………………… 23

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                          صفحه

فصل دوم: مروری بر منابع

2-1- مطالعات انجام شده………………………………………………………………………………………………… 27

فصل سوم: مواد و روش‌ها

3-1- نمونه برداری…………………………………………………………………………………………………………. 35

 

3-2-آماده سازینمونه‌هابرایآنالیزهایریخت‌سنجی…………………………………………………………………. 36

3-3- ریخت‌سنجی هندسی……………………………………………………………………………………………… 36

3-4- رشد آلومتری…………………………………………………………………………………………………………. 37

3-5- آلومتری چند متغیره……………………………………………………………………………………………….. 38

3-6- آنالیز CVA………………………………………………………………………………………………………….. 38

فصل چهارم: نتایج

4-1-نتایج بررسی‌های ریخت ظاهری ماهی……………………………………………………………………….. 43

4-2-آلومتری رشد………………………………………………………………………………………………………….. 46

4-3- آزمون کلاستر یا پراکندگی………………………………………………………………………………………. 58

4-4-ریخت‌سنجی هندسی……………………………………………………………………………………………….. 60

فصل پنجم: بحث

5-1- آلومتری رشد…………………………………………………………………………………………………………. 72

5-2- ضرایب رشد………………………………………………………………………………………………………….. 74

5-3- ریخت‌سنجی هندسی……………………………………………………………………………………………… 75

منابع……………………………………………………………………………………………………………………………….. 81

فهرست جدول‌ها

عنوان                                                                                                           صفحه

جدول1-1- اصطلاحات کلیدی و مترادف آنها…………………………………………………………………… 18

جدول3-1- سن، بیومتری و تعداد نمونه‌های جمع‌آوری شده……………………………………………… 39

جدول 4-1- ضرایب رشد (طول پوزه، طول سر، طول تنه، طول دم، قطر، ارتفاع بدنماهی کلمه قبل و بعد از نقطه عطف          56

جدول 4-2- ضرایب رشد (طول پوزه، طول سر، طول تنه، طول دم، قطر چشم، ارتفاع بدن ماهی کلمه قبل و بعد از جذب کیسه زرده………………………………………………………………………………………………………………………………………. 56

جدول 4-3- ضریب رشد طول پوزه، طول سر، طول تنه، طول دم، قطر چشم، ارتفاع بدن…….. 57

جدول 4-4- ضرایب رشد الگوی آلومتری چند متغیره……………………………………………………….. 58

فهرست شكل‌ها

عنوان                                                                                                           صفحه

شكل 1-1- مراحل مختلف حذف تفاوت‌ها در شکل………………………………………………………….. 14

شکل 3-1- ترتیب لندمارک گذاری در پیکره 9 لندمارکی…………………………………………………… 37

شکل 4-1- طول کل در مراحل تمایز پس از تفریخ ماهی کلمه……………………………………………. 46

شکل 4-2- روند تغییرات ضرایب رشد قسمت‌های مختلف بدن…………………………………………. 54

شکل 4-3- زمان نقاط عطف ضرایب رشد ماهی کلمه………………………………………………………… 55

شکل 4-4- طول کل مربوط به نقاط عطف ضرایب رشد ماهی کلمه…………………………………….. 55

شکل 4-5- طرح­های استخراجی از TPS Spline با توجه به Consensus مختصات پیکره­ی نه لندمارکی       67
شکل 4-6- تصاویر ماهی کلمه به ترتیب ازa تا e روز تفریخ، سه روز، سی روز، چهل و یک، و هشتاد روز پس از تفریخ          68

فهرست نمودار‌ها

عنوان                                                                                                           صفحه

نمودار4-1- ارتباط بین طول کل و وزن ماهی کلمه…………………………………………………………….. 47

نمودار4-2- روند تغییرات طول سر نسبت به طول کل ماهی کلمه……………………………………….. 48

نمودار 4-3- روند تغییرات طول تنه نسبت به طول کل ماهی کلمه………………………………………. 49

نمودار 4-4- روند تغییرات طول پوزه نسبت به طول کل ماهی کلمه نمودار…………………………. 50

نمودار 4-5- روند تغییرات طول دم نسبت به طول کل ماهی کلمه………………………………………. 51

نمودار 4-6- روند تغییرات ارتفاع بدن نسبت به طول کل ماهی کلمه…………………………………… 52

نمودار 4-7- روند تغییرات قطر چشم نسبت به طول کل ماهی کلمه……………………………………. 53

نمودار 4-8- میانگین ضریب آلومتری چندمتغیره ویژگی‌های مختلف ماهی کلمه از لحظه تفریخ تا روز هشتاد پس از آن           57

نمودار 4-9- درختی پراکندگی بدست آمده از تغییرات شکلی پیکره نه لندمارکی………………… 60

نمودار 4-10- خط سیر رشد بدست آمده از RW1 (پیکره­ی 9 لندمارکی) از روز صفر تا 80 بعد از تفریخ  62

نمودار 4-11- خط سیر رشد بدست آمده از RW2 (پیکره­ی 9 لندمارکی) از روز صفر تا 80 بعد از تفریخ  62

نمودار 4-12- روند تغییرات شکل ماهی کلمه (Rutilus rutilus caspicus) به طول کل در طی مراحل اولیه رشد از لحظه تفریخ تا 80 روز پس از تفریخ……………………………………………………………………………………………………………………. 63

نمودار 4-13- روند تغییرات RW1 و RW2……………………………………………………………………… 64

نمودار 4-14- روند تغییرات PC1 و PC2 در اشکال میانگین……………………………………………… 64

نمودار 4-15- روند تغییرات PC1 و PC2 در کل نمونه‌ها…………………………………………………… 64

نمودار 4-16- آنالیز CVA بر حسب مولفه کانونی اول و دوم شکل میانگین…………………………. 65

چکیده

این تحقیق جهت بررسی الگوی رشد، روند تغییرات شکل بدن در طی مراحل اولیه و تحلیل الگوی همبستگی ساختارهای بدن در طی مراحل اولیه رشدی و بررسی نقش عملکردی و کارآیی هر یک از مراحل شکلی ماهی کلمه (Rutilus rutilus caspicus)انجام شد. نمونه‌برداری در مجتمع بازسازی ذخایر ماهیان خاویاری سد وشمگیر از استخر 5/0 هکتاری که یک مزوکوم طبیعی جهت پرورش لارو‌های ماهی کلمه بود صورت گرفت. نمونه‌برداری از لحظه تفریخ شروع شد که در 12 روز ابتدایی به صورت روزانه، از روز 12 تا روز 30 با فواصل یک روزه و از روز 30 تا روز 45 با فواصل دو روزه و از روز 45 تا روز 60 با فواصل 5 روزه و از روز‌ 60 تا روز 80 با فواصل ده روزه صورت گرفت. نمونه‌ها در محلول بافر فسفاته فرمالدهید چهار تا 10 درصد تثبیت گردیدند. تهیه‌ی تصاویر با لوپمجهزبه دوربین کوداک6 مگاپیکسل،ازنیم‌رخ چپ انجام گرفت. اندازه‌ی طول پوزه، طول سر، طول تنه، طول دم، طول کل، قطر چشم، ارتفاع بدن با استفاده از نرم‌افزار ImageJ نسخه p1.44 از تصاویر استخراج شد.ریخت‌سنجی هندسی به روش لندمارک‌گذاری با استفاده از نرم‌افزارTpsDigنسخه 2.16 انجام شد. در ابتدا داده‌های مختصات لندمارک‌هابا استفاده از آنالیزGP[1] رویهم‌گذاری شدند و تغییرات شکلی در طی رشد به صورت شبکه‌ی تغییرات شکلی[2] توسط نرم‌افزارTpsregترسیم شد،همبستگی بین متغیرهای شکلی و طول کل با استفاده از آزمون همبستگی در نرم‌افزار PAST مورد بررسی قرار گرفت. در آنالیز تجزیه به مولفه‌های اصلی، تغییرات وابسته به مولفه‌های جدید انتخاب و خط سیر رشد با رسم محور RWA (بعنوان توصیف کننده شکل بدن) در برابر طول کل ترسیم شد.شکل میانگین شبکه‌ی تغییرات شکلی مربوط به آنها برای هر گروه سنی با استفاده از نرم‌افزار  TPS Splineمحاسبه شد.‌ به منظور خوشه بندی شکل بدن بین گروه‌های سنی آنالیز خوشه ای با استفاده از الگوریتم  Wardانجام شد آزمون چند متغیره با استفاده از داده‌های تبدیل و استاندارد شده به منظور بررسی معنی‌دار بودن یا نبودن اختلافات موجود در صفات آنتوژنیک استفاده شد. نتایج نشان داد آلومتری رشد همه نواحی مورد بررسی بدن ماهی کلمه به جز ناحیه تنه و قطر چشم در طی مراحل اولیه رشدی مثبت است. تغییرات ضرایب رشد نیز سه نقطه عطف را در روزهای سوم و سی‌ام و چهل و یکم پس از تفریخ نشان دادند. بر طبق نتایج آلومتری چند متغیره، ارتفاع بدن

داشته و با هزینه پایین تری راه اندازی می شوند. همچنین اتصال این تولیدات به شبکه های توزیع منافع و سودمندی های زیادی به دنبال دارد. از جمله مواردی که استفاده از واحدهای تولید پراکنده را مورد توجه قرار می دهد می توان به مسائلی نظیر مسائل اقتصادی در توسعه نیروگاه ها، کاهش آلودگی محیط زیست، بالا بردن بازدهی این منابع در تولید برق، بالا بردن کیفیت برق رسانی به مشتریان، کاهش تلفات در شبکه های توزیع، بهبود پروفیل ولتاژ، آزادسازی ظرفیت شبکه و بسیاری از موارد دیگر اشاره نمود.
فصل اول:
مقدمه ای بر تولیدات پراکنده
1-1- مقدمه
تولیدات پراکنده، یک مفهوم کاملا جدید نیست، بلکه در ابتدای شکل گیری صنعت برق، تولید برق به صورت محلی انجام می شد. با رشد صنعت برق، نیروگاه ها به صورت بزرگ و متمرکز و در نواحی دور از مصرف کننده های پایانی ایجاد شدند. امروزه، با رشد روزافزون تقاضای برق و نیز حرکت سیستم های قدرت از ساختار سنتی به سمت ساختار رقابتی و مشکلات اقتصادی و محیطی نیروگاه های بزرگ، تولیدات پراکنده جایگاه سابق خود را باز یافته است.