بر اساس نتایج این تحقیق بیس فنول آ موجب اختلال در یادگیری، تثبیت و بقای حافظه در روش یادگیری احترازی غیر فعال و باعث اختلال در توزیع زیر واحد NR1 گیرنده ی NMDA در هیپوكامپ، آمیگدال، مخچه و  قشر پری فرونتال مخ شد.

واژه های کلیدی: بیس فنول آ؛ یادگیری احترازی غیر فعال؛ شاتل باكس؛ هیپوكامپ؛ آمیگدال؛ مخچه؛ قشر پری فرونتال مخ؛ ایمنوهیستوشیمی؛ زیر واحد NR1 گیرنده ی NMDA؛ موش صحرایی نر

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                      صفحه

فصل اول : مقدمه ………………………………………………………………………………………………………… 2

 فصل دوم  مبانی نظری تحقیق

2 -1 زنواستر.ژن ها………………………………………………………………………………………………………………… 8

2-2 بیس فنول آ……………………………………………………………………………………………………………………. 8

2-3 حافظه و انواع آن………………………………………………………………………………………………………….. 10

2-3-1 حافظه ی کوتاه مدت………………………………………………………………………………………… 10

2-3-2 حافظه ی میان مدت…………………………………………………………………………………………. 10

2-3-3 حافظه ی بلند مدت………………………………………………………………………………………….. 12

2-3-4- حافظه ی اظهاری…………………………………………………………………………………………….. 12

2-3-5- حافظه ی غیر اظهاری…………………………………………………………………………………….. 13

2-4- یادگیری احترازی……………………………………………………………………………………………………….. 13

2-5- نقش مراکز عمده در یادگیری…………………………………………………………………………………… 15

2-5-1-هیپوکامپ……………………………………………………………………………………………………………. 15

2-5-2- مخچه………………………………………………………………………………………………………………….. 19

2-5-3- آمیگدال………………………………………………………………………………………………………………. 22

2-5-4- قشر پری فرونتال مخ………………………………………………………………………………………… 25

2-6- گیرنده های گلوتامات…………………………………………………………………………………………………. 28

2-7- گیرنده ی NMDA و نقش آن دریادگیری………………………………………………………………. 29

 2-8- LTP ،LTD  و مکانیسم عمل آنها…………………………………………………………………………… 32

2-9-هورمون های  استروئیدی و نقش آنها در یادگیری…………………………………………………… 38

2-9-1 شیمی هورمون های استروئیدی……………………………………………………………………….. 38

2-9-2- نقش هورمون های استروئیدی در یادگیری و حافظه……………………………………. 39

عنوان                                                                                                                      صفحه

فصل سوم : مواد و روش کار

3-1- ترکیبات شیمیایی و مواد مصرفی………………………………………………………………………………. 42

3-2- وسایل و دستگاه ها……………………………………………………………………………………………………… 43

3-3- حیوانات………………………………………………………………………………………………………………………… 43

3-4- دوره گاواژ حیوانات………………………………………………………………………………………………………. 44

3-5- القاء یادگیری احترازی در حیوان مورد مطالعه…………………………………………………………. 45

3-6- خارج کردن مغز و تثبیت بافت…………………………………………………………………………………… 46

3-7- آب‌گیری از بافت، شفاف سازی و پارافین دهی………………………………………………………… 47

3-8- قالب گیری در پارافین………………………………………………………………………………………………… 47

3-9- تهیه ی لام پلی الایزینه……………………………………………………………………………………………… 48

3-10- برش‌گیری و قرار دادن برش‌ها روی لام…………………………………………………………………. 48

3-11- تکنیک ایمنوهیستوشیمی……………………………………………………………………………………….. 49

3-12- طرز تهیه بافرPBS……………………………………………………………………………………………………. 50

3-13- روش تهیه بافر سیترات……………………………………………………………………………………………. 50

3-14- روش تهیه فرمالین 10 درصد بافره………………………………………………………………………… 51

3-15- روش تهیه فرمالین 4 درصد بافره…………………………………………………………………………… 51

3-16- طرز تهیه فتومیكروگراف از مقاطع بافتی………………………………………………………………… 51

3-17 – تعیین درصد تیرگی رنگ ایجاد شده……………………………………………………………………. 51

3-18- روش‌های آماری………………………………………………………………………………………………………… 52

فصل چهارم : نتایج

4-1- اثر بیس فنول آ بر یادگیری احترازی غیر فعال…………………………………………………………. 54

4-2- بررسی اثر بیس فنول آ بر تراکم زیر واحد NR1 گیرنده ی NMDA در سلول

 های پورکینژ مخچه………………………………………………………………………………………………………………. 56

4-3- اثر بیس فنول آ بر تراکم زیر واحد NR1 گیرنده ی NMDA در قشر پری

 فرونتال مخ موش صحرایی…………………………………………………………………………………………………… 60

4-4- اثر بیس فنول آ بر تراکم زیر واحد NR1 گیرنده ی NMDA در آمیگدال

موش صحرایی ……………………………………………………………………………………………………………………….. 63

4-5- اثر بیس فنول آ بر تراکم زیر واحد NR1 گیرنده ی NMDA در هیپوکامپ

موش صحرایی نر …………………………………………………………………………………………………………………… 68

عنوان                                                                                                                      صفحه

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری

5-1- اثر بیس فنول آ بر یادگیری و حافظه  …………………………………………………………………….. 78

5-2- اثر بیس فنول آ بر توزیع زیر واحد NR1 گیرنده ی NMDA در مخچه،

پری فرونتال مخ، هیپوکامپ و آمیگدال………………………………………………………………………………. 81

5-3- اثر بیس فنول آ و یادگیری احترازی غیر فعال بر توزیع زیر واحد NR1

گیرنده ی NMDA ………………………………………………………………………………………………………………. 85

5-4-نتیجه گیری ………………………………………………………………………………………………………………… 88

5-5- پیشنهادات ………………………………………………………………………………………………………………….. 88

 فهرست منابع و مأخذ 89

مقدمه

زنو استروژن ها1، استروژن های خارجی هستند که به صورت گسترده در ترکیبات صنعتی استفاده می شوند و علی رغم اینکه از لحاظ شیمیایی با استروژن های طبیعیِ ساخته شده توسط سیستم غدد داخلی بدن متفاوت هستند، اما دارای اثرات استروژنی در موجودات زنده می باشند Wolstenholn et al., 2010)). به این مواد، ” عوامل فعال هورمونی” و یا” مختل کننده های هورمونی[1] ” نیز گفته می شود(Kandaraki et al., 2009) . حضور فراگیر این مواد استروژنی، نگرانی عظیمی برای سلامت افراد و جمعیت ها می باشد Vidaeff., 2005) & (Sever. این مواد شیمیایی، به همراه پس آب منازل یا کارخانجات، وارد آب فاضلاب و
چرخه ی آب محیط می گردند و گیاهان و آبزیان را آلوده می کنند. تحقیقات، وجود زنواستروژن ها را در نارسایی های پزشکی مختلفی اثبات کرده است و در ده سال گذشته مطالعات علمی، شواهد زیادی را مبتنی بر عوارض سوء این مواد شیمیایی در سلامت انسان نشان داده است

          بیس فنول آ[2]، عمدتاً در ساخت پلاستیک های پلی کربناتی، اپوکسی رزین، برخی از مواد دندان پزشکی وبه عنوان ماده ی غیر پلیمری اضافه شونده به پلاستیک ها استفاده می شود. بیس فنول آ در 93% نمونه های ادراری در ایالات متحده تشخیص داده شده است؛ که نشان می دهد به میزان زیادی وارد بدن می شود(Vidaeff & Sever., 2005) . بیس فنول آ می تواند در سنتز و کلیرانس هورمون مداخله کند و همچنین بیان ژن گیرنده ها ی هورمون و فعالیت ژن بافت های هدف را تغییر دهد .(MacLusky et al., 2005)

یادگیری و حافظه از موضوعاتی است که بیشترین مطالعه در علوم اعصاب را به خود اختصاص داده و برای فهمیدن مکانیسم های سلولی و مولکولی آن شیوه های متفاوتی به کار گرفته شده است (Kim & junng 2006; Wang et al., 2006). تحقیقات فراوان نشان داده اند که مکان های مختلفی از مغز در فرایندهای حافظه و یادگیری دخالت دارند. از طرف دیگر بررسی های بی شماری در زمینه ی کشف مکانیسم های عصبی درگیر در این دو فرایند صورت گرفته است. اما با این وجود، مکانیسم های مؤثر در حافظه و یادگیری به حدّی متنوع و پیچیده هستند که برای شناخت کلیّه ی این مکانیسم ها بایستی تحقیقات گسترده تری صورت بگیرد (Kandel et al., 2000).

     یادگیری احترازی [3]، یکی از انواع حافظه و یادگیریِ غیر اظهاری است که در آن هر فرد رفتار یا پاسخی را برای اجتناب از یک موقعیت ناخوشایند یا استرس زا یاد می گیرد. این رفتار، شامل دوری کردن یا حذف شخص از آن موقعیت می باشد  .(Michael 2003)یادگیری احترازی، شامل دو نوع فعال و غیرفعال است. در نوع فعال، شرط اجتناب، به بروز پاسخ خاصی در حیوان بستگی دارد. ولی در نوع غیر فعال، به عدم پاسخ فرد وابسته است. یادگیری احترازی غیر فعال، نوعی فعالیت یادگیری ارتباطی[4] وابسته به هیپوکامپ محسوب می شود (Simonyi et al., 2007).

      دانشمندان علوم اعصاب در مورد نقش مهم هیپوکامپ در تشکیل حافظه های جدید پیرامون اتفاقات تجربه شده اتفاق نظر دارند (Squire & Schacter., 2002). قسمتی از این نقش هیپوکامپ، شرکت در تشخیص وقایع، مکان ها و محرکات جدید می باشد  .(VanElzakker . et al., 2008) هیپوکامپ، بیشترین تأثیر را در فرایند حافظه داشته و شاید بتوان گفت که ساختار اصلی مغزی در فرایندهای تقویت، به خاطر آوری و خاموش سازی حافظه در انسان است(Izquierdo., et al., 2004) . هیپوکامپ در حافظه ی بلند مدت و کوتاه مدت و چرخش فضایی نقش مهمی دارد (Zachepilo., et al., 2008).

یافته های متعدد نشان داده اند که مخچه در برخی از فرایندهای حافظه  نقش دارد (Kalmbach  . et al., 2009; Pakaprot et al., 2009; Wikgren et al., 2009) امروزه مشخص شده است که مخچه در یادگیری شرطی[5] (al.,2009  Thompson et (Gomez et al., 2010;، رفتارِ شناختی[6](Lalonde., et al., 1990) و یادگیری احساسی (Timmann., et al., 2009) نقش تعیین کننده ای دارد. همچنین وجود مخچه برای انواع یادگیری حرکتی نیز ضروری می باشد (Gómez., et al., 2010).  علاوه بر این، تحقیقاتی که روی نوعی ماهی طلایی [7]صورت گرفته، بیان کننده ی آن است که همانند آنچه در پستانداران رخ می دهد، یادگیریِ شرطی شدن کلاسیک، ارتباط بسیار زیادی به مخچه دارد .(Yang., et al., 2009)

آمیگدال، ساختاری متشکل از گروهی هسته، واقع در لوب گیجگاهی مغز است که نقش کلیدی در فرایند های احساسی و ترس دارد. همچنین نقش مستقیم آمیگدال در یادگیری احساسی نیز پیشنهاد شده (Galliot., et al 2009). مطالعات اخیر حاکی از آن است که آمیگدال در تعدیل عملکرد های هیپوکامپ نیز دخالت دارد. زیرا آسیب های آمیگدال می تواند در رفتارهای مربوط به ترس نقص ایجاد کند. همچنین اثر مستقیم آمیگدال بر یادگیری فضاییِ مرتبط با هیپوکامپ تأیید شده است(Sigurdsson., et al., 2006) . مطالعات نشان داده که تخریب و یا غیر فعال کردن هسته ی جانبی آمیگدال و نواحی کناری آن، در حین کسب اطلاعات جدید، از فرایند یادگیری ممانعت می کند و باعث تغییر فعالیت عصبی درهسته ی جانبی آمیگدال می گردد  Wolterink et al., 2001; Daenen etal., 2003; Terpstra et al., 2003)).

      قشر پری فرونتال مخ[8] مغز ناحیه ی قدامی لوب فرونتال مغز است که در رفتارهای پیچیده ی ادراکی مغز، بیان شخصیت، تصمیم گیری ها و مدیریت رفتارهای صحیح اجتماعی دخالت دارد  Yang.,  2009)& .(Raine  مطالعات روان شناختی پیشنهاد می کند قشر پری فرونتال مخ فرایندها ی کنترلی حافظه ی کاری و حافظه ی بلند مدت اپیزودیک را بر عهده دارد ) (Ranganath and Knight., . 2003

 NMDA یا N- متیل D- آسپارتات، یک گیرنده ی یونوتروپیک اختصاصی گلوتامات است که اتصال نوروترانسمیتر گلوتامات و NMDA به آن، گیرنده را که یک کانال یونی کلسیمی است، فعال می کند و باعث ورود یون های کلسیم به سلول پس سیناپسی و انتقال پیام عصبی می شود، که نقش مهمی را درشکل پذیری سیناپس ایفا می کند و مکانیسم سلولی در یادگیری و حافظه است(Wiess., 2007). این گیرنده با تراکم بالا در آمیگدال وجود دارد و بیشترین توزیع آن در منطقه ی CA1 هیپوکامپ می باشد. گیرنده های NMDA در CA1، در تنظیم شکل پذیری[9] سیناپسی و فرایند یادگیری و حافظه که شامل LTP و LTD است، نقش بسیار مهمی دارند. تحقیقات نشان داده، تجویز آگونیست هایNMDA  باعث پیشرفت در فرایند یادگیری می شود ((Izquierdo et al., 2004; chen et al., 2009; Grilli et al.,2009; Kandel al., 2000.

مطالعات فراوانی نشان می دهند که در پستانداران هورمون های جنسی از طریق اثر بر هیپوکامپ، یادگیری فضایی و حافظه را تحت تأثیر قرار می دهند Hodgson et al, 2008; ) (Mohaddes et al., 2009. وجود گیرنده های استروژنی در آمیگدال و هیپوکامپ، بیانگر نقش استروئیدهای جنسی در حفظ و تعدیل یادگیری و حافظه فضایی است.(Malin et al, 2007)  همچنین استروژن باعث افزایش در تراکم خارهای دندریتی[10]، افزایش فرکانس انتهای پیش سیناپسی می شود که می توا نند شکل پذیری را در هیپوکامپ افزایش دهند و این مسئله به طور مستقیم یادگیری و حافظه را افزایش می دهد (Wiess., 2007).

با توجه به اینکه زنواستروژن ها، به خصوص بیس فنول آ به طور گسترده ای از طرق مختلف وارد بدن انسان می شوند و عملکرد هورمون های استروئیدی را مختل می کنند، و از آنجایی که هورمون های استروئیدی نقش مهمی در فرایند های یادگیری اعمال می کنند و این
فرایند ها توسط گیرنده های NMDA میانجی گری می شوند، این تحقیق بر آن است تا اثر بیس فنول آ را بر توزیع زیر واحد NR1 گیرنده های NMDA در هیپوکامپ، مخچه، آمیگدال و قشر پری فرونتال مخ واثر آن را بر یادگیری احترازی غیر فعال در موش صحرائی نر
 بررسی کند.

مواد شیمیایی مثل حشره کشها، علف کشها، پلاستیک های کربناتی مختلف، شامپوها، ظروف یک بار مصرف، مواد غذایی کنسروی ناشی از شرایط اقتصادی و اجتماعی حاکم بر جهان امروز ماست. بر طبق آنچه که تا به حال ذکر شد، استروئیدها در دوز پایین باعث افزایش یادگیری و تقویت حافظه می شوند. در نتیجه باتوجه به نقش استروئید ها در رشد و عملکرد سیستم عصبی انتظار می رود که بیس فنول آ به علت تشابه ساختمان مولکولی بتواند عملکرد استروئیدها را در فرایند یادگیری دچار اختلال کند  .(Brinton., 2009)به این صورت که به سایت ویژه نورواستروئیدها در زیر واحد NR1 گیرنده ی NMDA باند شده مانع اتصال استروژن شده و موجب کاهش یادگیری می شود  .(Wiess.,