فهرست جداول 

عنوان
جدول 1-1 : برخی از پروتئین­های نو­ترکیب موجود در بازار دارویی………………………..3
جدول 2-1 : معایب و مزایای سیستم­های بیان کننده مختلف جهت تولید پروتئین­های نوترکیب…….12
جدول 3-1 : تعدادی از پروموترهای مورد استفاده برای بیان ژن در E. Coli…………..17
جدول 1-2 :ترکیبات مورد نیاز در سنتز CDNA…………………………………………………40
جدول 2-2 : ترکیب واکنش PCR(مقادیر بر حسب میكرولیتر)……………………………..42
جدول 3-2 : واکنش برش آنزیمی………………………………………………………………………46
جدول 4-2 :  ترکیبات واکنش اتصال  TNF-Αو PBR322………………………………..47
جدول 5-2 : فهرست سویه‌های E. Coli استفاده شده در این تحقیق……………………..47
جدول 6-2 : ترکیبات محیط کشت LB……………………………………………………………..48
جدول 7-2 : مخلوط واكنش برای برش آنزیمی……………………………………………………54
جدول 8-2 : اجزای واكنش اتصال……………………………………………………………………..54
جدول 9-2 : تهیه 12 میلی­لیتر محلول ژل پایین با غلظت 10 در صد………………………57
جدول 10-2 : تهیه 5 میلی لیتر محلول ژل بالا با غلظت 4 در صد………………………….57
جدول 11-2 : ترکیبات بافر نمونه (5x)……………………………………………………………..57
جدول 12-2 : ترکیبات بافر الکترود (بافر مخازن)…………………………………………………57
 

فهرست اشكال
شکل 1-1 : اجزاء اولیه و اصلی وكتور بیان­كننده ژن در E. Coli………………………………..16
شکل 2-1: نقشه كروموزوم MHC انسان و ژن HTNFα…………………………………………27
شکل 3-1 : ساختار كریستالی TNFα بر گرفته از Protein Data Bank………………..29
شکل 4-1 : شکل 4-1 مسیر سیگنالی TNFR1………………………………………………………33
شکل 1-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید PBR322 (اقتباس از فرمنتاس)…………………………..46
شکل2-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید PET21a (+) (اقتباس از فرمنتاس)………………………53
شكل 1-3 : چهار نمونه خون انسان سالم………………………………………………………………..62
شکل 2-3 : الکتروفورز RNA کل استخراج شده از 4 نمونه خون با استفاده از کیت……63
شکل 3-3 : الکتروفورز محصول تکثیر شده CDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای نو­ترکیب با روش PCR و با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز………………………………..64
شکل 4-3 : نقشه پلاسمید نوترکیبpBR322tnf ………………………………………………….65
شکل 5-3 : الگوی برش نخورده پلاسمیدهای نو­ترکیب PBRtnf در مقایسه با PBR322 فاقد CDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا……………………………………………………………66
شکل 6-3 : الکتروفورز محصول واکنش PCR بر روی پلاسمیدهای نو­ترکیب بر روی ژل آگارز………67
شكل 7-3 : نقشه پلاسمید نوترکیب PET21tnf…………………………………………………….68
شکل8-3 : نتایج الکتروفورز محصول  PCRپلاسمید نو­ترکیب PETtnf با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………………………………69
شکل 9-3 : الکتروفورز محصول پلاسمید نوترکیب PET21tnf برش یافته با آنزیم های NdeI، HindIII و بریده شده با دو آنزیم NdeI– HindIIIبر روی ژل آگارز…………..70
شکل 10-3 : توالی نوکلئوتیدی ژن TNF و اسیدآمینه­ای ترجمه شده آن از یکی از کلون های نو­ترکیب به دست آمده، PET21tnf………………………………………………………71
شکل 11-3 : بیان ژن TNF-Α انسانی در BL21 E. Coli………………………………………72
شکل 12-3 : مقایسه غلظت­های مختلف IPTG بر روی بیان……………………………………73
شکل 13-3 : مقایسه بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء…………………………….73
شکل 14-3 : نتایج وسترن بلاتینگ بیان پروتئین نوترکیب در غلظت­های 0625/0، 125/0، 5/0و 1 میلی­مولار..74
علایم اختصاری:

LB: Luria Bertani

NK cell: Natural killer cell

OD: Optical Density

TNF: Tumor Necrosis Factors

TAE: Tris-acetate EDTA

SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis

RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction

rhTNF-α: Recombinant human Tumor Necrosis Factor alpha

MCS: Multiple cloning site

LPS: Lipopolysaccharide

IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

IL: Interleukin

INF: Interferon

EDTA: Ethylene diamine tetra acetic acid

DW: Distilled water

APS: Ammonium persulfate

MS: Multiple Sclerosis

TEMED: N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine or N,N,N’,N’-Tetramethyl-1,2-diaminoethan

TE: Tris EDTA

TM: Melting temperature 

RCLB: Red Cell Lysis Buffer

CTL : Cytotoxic T cell

X-gal: bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside

MHC: Major Histocompatibility Complex

AD: Alzheimer’s disease

PD: Parkinson’s disease

LT: Lymphotoxin

TLR: Toll-like receptor

FADD: Fas-Associated protein with Death Domain

RIP: Receptor Interacting Protein

چکیده

سایتوکاین ها خانواده ای از فاكتورهای رشد هستند که توسط سلول های سیستم ایمنی ترشح می شوند. این خانواده شامل اینترلوکین ها (IL)، اینترفرون ها (IFN)، فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)، کموکاین ها و سایر فاکتورهای رشد می باشند. فاکتور نکروز کنندۀ تومور، بعنوان یك مولکولی با خصوصیات آنتی توموری است که عمدتاً توسط ماکروفاژهای تحریك شده با باکتری ترشح می شود. علیرغم ابنكه مقادیر محدودی TNF-α از منابع طبیعی آن بدست می آید اما مقادیر زیادی از فرم محلول آن (مورد نیاز برای مطالعات ساختاری و عملکردی) را می توان به آسانی توسط تکنولوژی DNA نوترکیب به دست آورد. بنابراین ترجیح داده می شود برای تولید این پروتئین نوترکیب از سیستم های ساده میكروبی و نیز گیاهان استفاده گردد.

در اینجا به منظور مطالعه بیان TNFα انسانی، cDNA کد کنندۀ hTNFα حاصل از RT-PCR ی mRNA سلول های ماکروفاژ انسان، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی از قبل طراحی شده تکثیر گردید. محصول PCR خالص سازی شده، در سایت برشی EcoRV که در داخل ناحیه کد کننده مقاومت به تتراسایکلین در pBR322 بود، الحاق شد. سرانجام به منظور بیان، ژن هدف در پلاسمید  تحت کنترل سیگنال های رونویسی و ترجمه قوی پروموتور باکتریوفاژ T7 كلون گردید به این ترتیب كه وكتور نوتركیب و نیز هر دو با آنزیم های NdeI-HindIII بریده شده و قطعهDNA bp 478 حاصل از برش pBRtnf در pET21a(+) خطی شده، اتصال و سپس در E. coli DH5α ترانسفورم شد. پس از بررسی صحت