جفت باز شناسائی شد سپس این قطعه به کمک PCR از ژنوم هلیکوباکتر پیلوری موجود در بیوپسی معده 30 بیمار مبتلا به این باکتری جدا شده و با استفاده از هضم آنزیمی به ناقل  pET32a و سپس به داخل میزبان‌های کلون سازی و بیانی وارد شد.  نتایج توالی یابی کلونیگ موفق ژن CagA را نشان داد و در نهایت ترکیب پروتئینی بدست آمده توسط روش SDS-PAGE و دات بلات تائید شد. در مرحله بعد ترکیب پروتئینی بدست آمده به 3 مرغ از نژاد HY-LINE تزریق شد. تخم مرغ‌ها به مدت 10 هفته جمع آوری شدند و IgY تولید شده در زرده تخم مرغ آنها با استفاده از روش SDS-PAGE بررسی و تائید شد.

 

کلمات کلیدی: مهندسی آنتی بادی،کیت تشخیصی، ایمنوژنتیک

 

عنوان                                                                                                          صفحه
1 مقدمه. 1

1-1 اهمیت موضوع. 1

1-2 اهداف تحقیق.. 4

2 بررسی منابع.. 5

2-1 مکمل‌ها و غذاهای عمل گرا 5

2-1-1 تفاوت غذای عمل گرا و مکمل غذائی.. 6

2-2 ایمنوگلوبین Y. 6

2-2-1 ایمنوگلوبین زرده ی تخم مرغ (IgY). 7

2-2-2 ویژگی‌ها 9

2-2-3 کاربرد‌های بیوآنالایتیک… 9

2-2-4 استفاده در مواد غذائی.. 10

2-3 هلیکو باکتر پیلوری.. 11

2-3-1 علائم و نشانه‌ها 11

2-3-2 میکروبیولوژی.. 12

2-3-3 ژنوم. 13

2-3-4 زیرواحد CagA هلیکوباکتر پیلوری.. 14

2-3-5 نقش CagA در سرطان. 15

2-3-6 پاتوفیزیولوژی.. 15

2-3-7 التهاب، ورم معده و زخم. 16

2-3-8 جزیره بیماریزائی Cag.. 17

2-3-9 سرطان. 18

2-3-10 آسیب شناسی.. 19

2-3-11 پیشگیری.. 19

2-3-12 درمان. 20

2-3-13 پیش بینی بیماری.. 21

2-3-14 بقاء هلیکوباکتر پیلوری.. 22

2-3-15 همه گیر شناسی باکتری (Epidemiology). 24

2-4 آنتی ژن‌ها 25

2-4-1 ساختمان آنتی ژن. 25

2-5 اپی توپ‌ها 26

2-5-1 انواع اپی توپ‌ها 26

2-5-2 عملکرد. 27

2-5-2-1 اپی توپ‌های سلول T.. 27

2-5-3 واکنش متقاطع.. 28

2-5-4 نقشه برداری اپی توپ فضائی.. 28

2-5-5 نشانه‌های اپی توپ… 28

2-6 تحقیقات انجام شده در این زمینه. 29

2-7 ابزار‌های مورد استفاده 38

2-7-1 دات بلاتینگ… 38

2-7- 2 نرم افزار CLC Work Bench5. 38

  http://zusa.ir/%d9%be%d8%a7%db%8c%d8%a7%d9%86-%d9%86%d8%a7%d9%85%d9%87-%d9%85%d8%af%db%8c%d8%b1%db%8c%d8%aa-%d8%b1%db%8c%d8%b3%da%a9-%d9%88-%da%a9%d8%a7%d8%b1%d8%a7%db%8c%db%8c-%d8%b4%d8%b9%d8%a8-%d8%a8%d8%a7%d9%86/

2-7-3 نرم افزار Mega5. 39

2-7-4 ابزار BLAST.. 39

3 مواد و روش‌ها 40

3-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 40

3-2 تهیه باکتری هلیکو باکتر پیلوری.. 41

3-3 استخراج DNA و تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده 41

3-3-1 تعیین کمیت و کیفیت DNA با ژل آگارز. 41

3-4 تعیین غلظت DNA استخراج شده 42

3-5 طراحی آغازگرها 42

3-6 انجام واکنش PCR.. 43

3-7 خالص سازی محصول PCR.. 44

3-7-1 بررسی بر روی ژل الکتروفورز. 45

3-8 طرز تهیه محلولهای مورد استفاده در کلونینگ… 45

3-8-2 محلول غلیظ آنتی بیوتیک آمپیسیلین.. 46

3-8-3 محلول غلیظ IPTG  (0. 1M). 46

3-8-4 محلول غلیظ X-Gal  (20mg/ml). 46

3-8-5 محیط کشت LB مایع.. 46

3-8-6 محیط کشت LB-Agar جامد. 47

3-9-2 هضم pET-32a  (+). 49

3-9-3 خالص سازی pET-32a  (+) و قطعه هدف… 49

3-9-4 نانودراپ محصولات خالص شده 50

3-9-5 انجام واکنش الحاق قطعه هدف ژن CagA با pET-32a  (+). 50

3-9-6 جوان سازی باکتری DH5α.. 51

3-9-7 تهیه سلول‌های مستعد DH5α.. 52

3-9-8 انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری.. 52

3-9-9 کشت پرگنه‌‌ها و غربال گری باکتری های نوترکیب… 53

3-9-10 کلونی PCR.. 53

3-9-11 استخراج پلاسمید نوترکیب… 54

3-9 -12 تایید کلونیها از طریق هضم آنزیمی.. 55

3-10 توالی یابی.. 56

3-11 انتقال پلاسمید pET-32a (+) حاوی ژن هدف به باکتری BL21 (DE3). 56

3-12 تحریک بیان ژن هدف… 56

3-13 استخراج پروتئین از باکتری.. 57

3-14 الکتروفورز پروتئینها به روش SDS-PAGE. 58

3-14-1 مراحل بستن ژل به صورت زیر انجام شد: 59

3-15 دات بلات… 61

3-16 محلولها و بافرها 62

3-16-1 بافر شستشو یا محلول TBS. 62

3-16-2 محلول بلوکه کننده 62

3-16-3 بافر شستشو یا محلول TBS-T.. 62

3-16-4 آنتیبادی اولیه. 62

3-16-5 آنتیبادی ثانویه. 62

3-16-6 روش تهیه محلول رنگ آمیزی DAB.. 62

3-17 خالص سازی پروتئین.. 64

3-18 آماده سازی آنتی ژن ایمنی زا برای تزریق به مرغ. 64

3-19 ایمنی زائی مرغ‌ها جهت تولید آنتی بادی اختصاصی.. 65

3-19-1 تزریق اولیه: 65

3-19-2 تزریق‌های ثانویه  (Booster injection). 66

3-20 جمع آوری و ذخیره تخم مرغ. 66

3-21 جداسازی IgY با استفاده از روش پلی اتیلن گلایکول 14700.. 66

3-22 بررسی IgY به روش الکتروفورز SDS-PAGE و دات بلات… 67

4 نتایج و بحث… 67

4-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 67

4-2 تایید آلودگی نمونه‌های بیوپسی.. 69

4-3 تعیین کمیت و کیفیت DNA.. 69

4-4 بررسی محصولات PCR.. 70

4-5 خالص سازی محصول PCR.. 71

4-6 هضم PET32a (+) و ژن CagA.. 71

4-7 کلونینگ ژن CagA در باکتری DH5α.. 72

4-8 تأیید صحت قطعه کلونشده در pET32a (+). 73

4-9 نتایج کلونی PCR.. 73

4-10 تایید نتایج کلونی PCR با استفاده از T7. 74

4-11 استخراج پلاسمید و انجام هضم آنزیمی.. 75

4-12 توالی یابی.. 76

4-13 آنالیز فیلوژنتیکی توالی آمینواسیدی CagA.. 76

4-14 بیان ژن. 78

4-15 SDS-PAGE. 78

4-16 دات بلات… 79

4-18 تولید IgY ضد هلیکو باکتر پیلوری-CagA در زرده تخم مرغ. 81

5 نتیجه گیری و پیشنهادات… 85

فهرست شکل‌ها

          عنوان                                                                                                    صفحه
شکل 4-1.  نتایج نرم افزار bcepred. 68

شکل 4-2. تست اوره آز انجام شده بر روی نمونه‌های بیوپسی. 69

شکل 4-3. تعیین کیفیت و کمیت DNA. 70

شکل4-5. خالص سازی محصول PCR . 71

شکل4-6. هضم ناقل بیان و قطعه هدف… 72

شکل4-7. کشت خطی از تک کلون‌های رشد کرده بر روی محیط کشت LB-آگار حاوی آمپی سیلین.. 73

شکل 4-8. کلونی PCR. 74

شکل4-9. کلونی PCR با استفاده از پرایمر T7 و T-terminatoor. 75

شکل 4-10. استخراج پلاسمید نوترکیب و هضم آنزیمی.. 76

شکل 4-12. بررسی بیان پروتئین نوترکیب با الکتروفورزSDS-PAGE 78

شکل 4-13. دات بلات پروتئینهای استخراج شده. 79

شکل 4-14.تعیین غلظت پروتئین با استفاده از روش برادفورد. 81

شکل 4-15.خالص سازی پروتئین و حذف باند‌های غیر اختصاصی. 81

شکل 4-16. الکتروفورز SDS-PAGE به منظور بررسی پروتئین زنجیره سبک و سنگین IgY استخراج شده از زرده تخم مرغ  82

فهرست جدول‌ها

عنوان                                                                                                          صفحه
جدول 3-1 مواد و مقادیر لازم برای انجام PCR یک واکنش…. 43

جدول3-2. برنامه حرارتی مورد استفاده جهت تکثیر نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 44

جدول3-3 مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت LB مایع.. 46

جدول3-4 مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت جامد LB-Agar. 47

جدول 3-5 مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم قطعه هدف ژنCagA.. 48

جدول 3-6. مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم pET-32a (+) 49

جدول3-7. مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش الحاق.. 50

جدول 3-8. مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم پلاسمید pET32a (+)-CagA.. 55

جدول3-9. مواد مورد نیاز برای تهیه بافر Laemmli buffer samples 5X. 58

جدول3-10 مواد و مقادیر لازم جهت تهیه ژل پایینی SDS-PAGE. 58

جدول 3-11 مواد لازم جهت بستن ژل بالایی SDS-PAGE. 59

جدول3-12. مواد و مقادیر مورد نیاز برای بافر 5X تانک SDS-PAGE. 59

فهرست علائم و اختصارات

معادل فارسی
معادل لاتین
علامت اختصاری
 
 
 
آدنوزین دی فسفات
Adenosine 5’-Diphosphate
ADP 

 
آدنوزین تری فسفات
Adenosine 5’-Triphosphate
ATP
جفت باز
Base Pair
Bp
سرم البومین گاوی
Bovain Serum Albumin
BSA
دی آمینو بنزیدین
Diamino Benzidine
DAB
آب دوبار تقطیر
Double Distilled Water
DdW
اسید دزوکسی ریبو نوکلئیک
Deoxyribonocleic Acid
DNA
اتیلن دیامین تترا- استیک اسید
Ethylenediaminetetra-Acetic Acid
EDTA
سازمان امنیت محصولات غذایی
Generally Regarded As Safe
GRAS
ایمنو گلوبین Y
Immunoglobulin Y
IgY
ایمنوگلوبین E
Immunoglobulin E
IgE
ایمنوگلوبین G
Immunoglobulin G
IgG
میواینوزیتول هگزاکیس فسفات
Myo-Inositol Hexakisphosphate
Ins P6
اینوزیتول پلی فسفات­ها
Inositol Poly Phosphates
IPPs
تیوگالاکتوپیرانوزید ایزوپروپیل
Isopropyl Β -D-Thiogalactopyranoside
IPTG
اتحادیه بین الملل شیمی خالص و کاربردی- اتحادیه بین المللی بیوشیمی
International Union Of Pure And Applide Chemistry- International Union Of Biochemistry
IUPAC- 

IUB
کیلوباز
Kilobase  (Pair)
Kb
کیلودالتون
KiloDalton
KDa
لوریا- برتانی
Lauria – Bertani
LB
بانک جهانی اطلاعات بیوتکنولوژی
National Center Of Biotechnology Information
NCBI
چگالی نوری
Optic Density
OD
چارچوب خواندن آزاد
Open Reading Frame
ORF
 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز
Polymerase Chain Reaction
PCR
پروتئین تیروزین فسفات
Protein Tyrosine Phosphatase
PTP
پلی اتیلن گلایکول
Polyethylene Glycol
PEG3
جایگاه اتصال ریبوزوم
Ribosomal Binding Site
RBS
دور در دقیقه
Round Per Minute
Rpm
سدیم دودسیل سولفات – 

ژل الکتروفورز پلی­اکریل آمید
Sodium Dodecyl Sulfate – 

Polyacryl Amide Gel Electrophoresis
SDS-PAGE
مقدمه
1-1 اهمیت موضوع